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Ma quanti sono i coronavirus

https://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(20)30251-8/fulltext

Sommario a Ma quanti sono i coronavirus Mi pare che sia un problema per specialisti il trovrne L'ORIGINE

 

Alla fine di dicembre 2019, i pazienti che presentavano polmonite virale a causa di un agente microbico non identificato sono stati segnalati a Wuhan, in Cina. Un nuovo coronavirus è stato successivamente identificato come patogeno causativo, provvisoriamente chiamato romanzo coronavirus 2019 (2019-nCoV). A partire dal 26 gennaio 2020, sono stati confermati più di 2000 casi di infezione 2019-nCoV, la maggior parte dei quali ha coinvolto persone che vivono o visitano Wuhan e la trasmissione da uomo a uomo è stata confermata.

metodi

Abbiamo eseguito il sequenziamento di nuova generazione di campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare e di isolati in coltura di nove pazienti ricoverati, otto dei quali avevano visitato il mercato del pesce di Huanan a Wuhan. Queste sequenze del genoma 2019-nCoV complete e parziali sono state ottenute da questi individui. I contig virali sono stati collegati usando il sequenziamento di Sanger per ottenere i genomi a lunghezza intera, con le regioni terminali determinate dalla rapida amplificazione delle estremità del cDNA. L'analisi filogenetica di questi genomi 2019-nCoV e quelli di altri coronavirus è stata utilizzata per determinare la storia evolutiva del virus e aiutare a inferirne la probabile origine. La modellazione dell'omologia è stata effettuata per esplorare le probabili proprietà di legame del recettore del virus.

I risultati

Le dieci sequenze del genoma del 2019-nCoV ottenute dai nove pazienti erano estremamente simili, esibendo un'identità di sequenza superiore al 99-98%. In particolare, 2019-nCoV era strettamente correlato (con l'88% di identità) a due coronavirus gravi simili alla sindrome respiratoria acuta derivati ​​da pipistrelli, bat-SL-CoVZC45 e bat-SL-CoVZXC21, raccolti nel 2018 a Zhoushan, nella Cina orientale , ma erano più distanti da SARS-CoV (circa il 79%) e MERS-CoV (circa il 50%). L'analisi filogenetica ha rivelato che 2019-nCoV rientrava nel sottogenere Sarbecovirus del genere Betacoronavirus, con una lunghezza del ramo relativamente lunga rispetto ai suoi parenti più vicini bat-SL-CoVZC45 e bat-SL-CoVZXC21 ed era geneticamente distinto da SARS-CoV. In particolare, il modello di omologia ha rivelato che il 2019-nCoV aveva una struttura di dominio simile a quella del SARS-CoV,

Interpretazione

2019-nCoV è sufficientemente divergente dalla SARS-CoV per essere considerato un nuovo betacoronavirus che infetta l'uomo. Sebbene la nostra analisi filogenetica suggerisca che i pipistrelli potrebbero essere l'ospite originale di questo virus, un animale venduto al mercato ittico di Wuhan potrebbe rappresentare un ospite intermedio che facilita l'emergere del virus nell'uomo. È importante sottolineare che l'analisi strutturale suggerisce che 2019-nCoV potrebbe essere in grado di legarsi al recettore dell'enzima 2 che converte l'angiotensina nell'uomo. La futura evoluzione, adattamento e diffusione di questo virus meritano un'indagine urgente.

finanziamento

Programma nazionale di ricerca e sviluppo chiave della Cina, importante progetto nazionale per il controllo e la prevenzione delle malattie infettive in Cina, Accademia cinese delle scienze, prima Università medica di Shandong.

 

Isolamento del virus

Le cellule epiteliali delle vie aeree umane prive di patogeni speciali (HAE) sono state utilizzate per l'isolamento del virus. In breve, i liquidi di lavaggio broncoalveolare o i tamponi di gola dei pazienti sono stati inoculati nelle cellule HAE attraverso le superfici apicali. Le cellule HAE sono state mantenute in un'interfaccia aria-liquido incubata a 37 ° C. Le cellule sono state monitorate quotidianamente per gli effetti citopatici mediante microscopia ottica e i supernatanti cellulari sono stati raccolti per l'uso in saggi quantitativi di RT-PCR. Dopo tre passaggi, sono stati raccolti campioni apicali per il sequenziamento.

 Strategia di sequenziamento BGI

Tutti i campioni raccolti sono stati inviati a BGI per il sequenziamento. 140 μL di campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare (da WH01 a WH04) sono stati riservati per l'estrazione di RNA utilizzando il mini kit QIAamp Viral RNA (52904; Qiagen, Heiden, Germania), secondo le raccomandazioni del produttore. Una tecnica catturata dalla sonda è stata utilizzata per rimuovere l'acido nucleico umano. L'RNA rimanente è stato trascritto inverso in cDNA, seguito dalla sintesi del secondo filamento. Utilizzando il DNA sintetico a doppio filamento, è stata costruita una libreria di DNA attraverso la frammentazione del DNA, la riparazione finale, la legatura dell'adattatore e l'amplificazione della PCR. La biblioteca costruita è stata qualificata con un fluorometro Invitrogen Qubit 2.0 (ThermoFisher, Foster City, CA, USA) e la biblioteca di DNA a doppio filamento qualificata è stata trasformata in una biblioteca di DNA circolare a singolo filamento attraverso denaturazione e circolarizzazione del DNA.
Dopo aver rimosso le letture dell'adattatore, di bassa qualità e di bassa complessità, sono stati generati dati di sequenziamento del genoma di alta qualità. Le letture della sequenza sono state inizialmente filtrate contro il genoma di riferimento umano (hg19) usando Burrows-Wheeler Alignment.  I dati rimanenti sono stati quindi allineati al database nucleotidico locale (utilizzando Burrows-Wheeler Alignment) e al database proteico non ridondante (utilizzando RapSearch), scaricato dal sito Web del National Center for Biotechnology Information degli Stati Uniti , che contiene solo i coronavirus che sono stati pubblicati. Infine, le letture mappate sono state assemblate con SPAdes  per ottenere una sequenza del genoma del coronavirus di alta qualità.
I primer sono stati progettati con l'uso del software OLIGO Primer Analysis versione 6.44 sulla base del genoma parziale assemblato e sono stati verificati da Primer-Blast (per maggiori dettagli sui sequencer di primer utilizzati, contattare l'autore corrispondente). La PCR è stata impostata come segue: 4 · 5 μL di buffer 10X, 4 μL di miscela dNTP (2 · 5 μmol / L), 1 μL di ciascun primer (10 μmol / L) e 0 · 75 unità di HS Ex Taq (Takara Biomedical Technology, Pechino, Cina), per un volume totale di 30 μL. I cDNA inversi trascritti da campioni clinici sono stati usati come modelli e sono stati usati primer casuali. Sul termociclatore è stato eseguito il seguente programma: 95 ° C per 5 minuti; 40 cicli di 95 ° C per 30 secondi, 55 ° C per 30 secondi e 72 ° C per 1 minuto secondo la dimensione del prodotto; 72 ° C per 7 minuti; e una presa di 4 ° C. Infine, i prodotti PCR sono stati separati mediante elettroforesi su gel di agarosio,

 Strategia di sequenziamento del CDC cinese

Le sequenze del genoma intero del 2019-nCoV da sei campioni (WH19001, WH19005, WH19002, WH19004, WH19008 e YS8011) sono state generate da una combinazione di sequenze di nanopori Sanger, Illumina e Oxford. Innanzitutto, gli RNA virali sono stati estratti direttamente dai campioni clinici con il Mini Kit QIAamp Viral RNA e quindi utilizzati per sintetizzare il cDNA con SuperScript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher, Waltham, MA, USA) e N6 primer casuali, seguiti dalla sintesi del secondo filamento con DNA polimerasi I, frammento grande (Klenow) (ThermoFisher). Le librerie virali di cDNA sono state preparate con l'uso del Nextera XT Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA), quindi purificate con perline Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), seguite da quantificazione con un Invitrogen Qubit 2.0 Fluorometro. Le librerie di DNA risultanti sono state sequenziate sulle piattaforme MiSeq o iSeq (Illumina) usando un kit di reagenti a 300 cicli. Sono stati ottenuti circa 1–5 GB di dati per ciascun campione.

 

Coronavirus grave correlato alla sindrome respiratoria acuta      Fare clic sul nome dell'organismo per ottenere maggiori informazioni.

 

Bat coronavirus RaTG13   

Bat coronavirus Cp / Yunnan2011   

Bat coronavirus Rp / Shaanxi2011   

 

Pipistrello SARS coronavirus HKU3   

 

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-1   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-10   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-11   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-12   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-13   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-2   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-3   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-4   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-5   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-6   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-7   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-8   

Pipistrello SARS coronavirus HKU3-9   

 

Pipistrello SARS coronavirus Rp1   

Pipistrello SARS coronavirus Rp2   

 

Bat SARS CoV Rf1 / 2004   

Bat CoV 273/2005   

Bat SARS CoV Rm1 / 2004   

Bat CoV 279/2005   

 

Bat SARS CoV Rp3 / 2004   

Pipistrello coronavirus simile alla SARS   

Pipistrello Coronavirus simile a SARS Rs3367   

Pipistrello coronavirus simile alla SARS RsSHC014   

Pipistrello coronavirus simile a SARS WIV1   

Pipistrello coronavirus simile alla SARS YNLF_31C   

Pipistrello coronavirus simile alla SARS YNLF_34C   

BTRF-BetaCoV / HeB2013   

BTRF-BetaCoV / JL2012   

BTRF-BetaCoV / SX2013   

BTR-BetaCoV / GX2013   

BTR-BetaCoV / HuB2013   

BTR-BetaCoV / YN2013   

Civet SARS CoV 007/2004   

Civet SARS CoV SZ16 / 2003   

Civet SARS CoV SZ3 / 2003   

 

SARSr-CoV ricombinante   

SARS coronavirus ExoN1   

SARS coronavirus MA15   

SARS coronavirus MA15 ExoN1   

SARS coronavirus wtic-MB   

 

Rhinolophus affinis coronavirus   

Coronavirus di pipistrello SARS   

SARS coronavirus A001   

SARS coronavirus A013   

SARS coronavirus A021   

SARS coronavirus A022   

SARS coronavirus A030   

SARS coronavirus A031   

SARS coronavirus AS   

SARS coronavirus B012   

SARS coronavirus B024   

SARS coronavirus B029   

SARS coronavirus B033   

SARS coronavirus B039   

SARS coronavirus B040   

SARS coronavirus BJ01   

SARS coronavirus BJ02   

SARS coronavirus BJ03   

SARS coronavirus BJ04   

SARS coronavirus BJ162   

SARS coronavirus BJ182-12   

SARS coronavirus BJ182-4   

SARS coronavirus BJ182-8   

SARS coronavirus BJ182a   

SARS coronavirus BJ182b   

SARS coronavirus BJ202   

SARS coronavirus BJ2232   

SARS coronavirus BJ302   

SARS coronavirus C013   

SARS coronavirus C014   

SARS coronavirus C017   

SARS coronavirus C018   

SARS coronavirus C019   

SARS coronavirus C025   

SARS coronavirus C028   

SARS coronavirus C029   

SARS Coronavirus CDC # 200301157   

SARS coronavirus civet010   

SARS coronavirus civet014   

SARS coronavirus civet019   

SARS coronavirus civet020   

SARS coronavirus CS21   

SARS coronavirus CS24   

SARS coronavirus CUHK-AG01   

SARS coronavirus CUHK-AG02   

SARS coronavirus CUHK-AG03   

SARS coronavirus CUHK-L2   

SARS coronavirus CUHK-Su10   

SARS coronavirus CUHK-W1   

SARS coronavirus cw037   

SARS coronavirus cw049   

SARS coronavirus ES191   

SARS coronavirus ES260   

SARS coronavirus FRA   

 

SARS coronavirus Francoforte 1   

SARS coronavirus Frankfurt1-v01   

 

SARS coronavirus GD01   

SARS coronavirus GD03T0013   

SARS coronavirus GD322   

SARS coronavirus GD69   

SARS coronavirus GDH-BJH01   

SARS coronavirus GZ-A   

SARS coronavirus GZ-B   

SARS coronavirus GZ-C   

SARS coronavirus GZ-D   

SARS coronavirus GZ02   

SARS coronavirus GZ0401   

SARS coronavirus GZ0402   

SARS coronavirus GZ0403   

SARS coronavirus GZ43   

SARS coronavirus GZ50   

SARS coronavirus GZ60   

SARS coronavirus HB   

SARS coronavirus HC / SZ / 61/03   

SARS coronavirus HGZ8L1-A   

SARS coronavirus HGZ8L1-B   

SARS coronavirus HGZ8L2   

SARS coronavirus HHS-2004   

SARS coronavirus HKU-36871   

SARS coronavirus HKU-39849   

SARS coronavirus HKU-65806   

SARS coronavirus HKU-66078   

SARS coronavirus Hong Kong / 03/2003   

SARS coronavirus HPZ-2003   

SARS coronavirus HSR 1   

SARS coronavirus HSZ-A   

SARS coronavirus HSZ-Bb   

SARS coronavirus HSZ-Bc   

SARS coronavirus HSZ-Cb   

SARS coronavirus HSZ-Cc   

SARS coronavirus HSZ2-A   

SARS coronavirus HZS2-Bb   

SARS coronavirus HZS2-C   

SARS coronavirus HZS2-D   

SARS coronavirus HZS2-E   

SARS coronavirus HZS2-Fb   

SARS coronavirus HZS2-Fc   

SARS coronavirus JMD   

SARS coronavirus LC1   

SARS coronavirus LC2   

SARS coronavirus LC3   

SARS coronavirus LC4   

SARS coronavirus LC5   

SARS coronavirus LLJ-2004   

SARS coronavirus NS-1   

SARS coronavirus P2   

SARS coronavirus PC4-115   

SARS coronavirus PC4-127   

SARS coronavirus PC4-13   

SARS coronavirus PC4-136   

SARS coronavirus PC4-137   

SARS coronavirus PC4-145   

SARS coronavirus PC4-199   

SARS coronavirus PC4-205   

SARS coronavirus PC4-227   

SARS coronavirus PC4-241   

SARS coronavirus PUMC01   

SARS coronavirus PUMC02   

SARS coronavirus PUMC03   

SARS coronavirus Rs_672 / 2006   

SARS coronavirus sf098   

SARS coronavirus sf099   

SARS coronavirus ShanghaiQXC1   

SARS coronavirus ShanghaiQXC2   

SARS coronavirus Shanhgai LY   

SARS coronavirus Sin0409   

SARS coronavirus Sin2500   

SARS coronavirus Sin2677   

SARS coronavirus Sin2679   

SARS coronavirus Sin2748   

SARS coronavirus Sin2774   

SARS coronavirus Sin3408   

SARS coronavirus Sin3408L   

SARS coronavirus Sin3725V   

SARS coronavirus Sin3765V   

SARS coronavirus Sin842   

SARS coronavirus Sin845   

SARS coronavirus Sin846   

SARS coronavirus Sin847   

SARS coronavirus Sin848   

SARS coronavirus Sin849   

SARS coronavirus Sin850   

SARS coronavirus Sin852   

SARS coronavirus Sin_WNV   

SARS coronavirus Sino1-11   

SARS coronavirus Sino3-11   

SARS coronavirus SinP1   

SARS coronavirus SinP2   

SARS coronavirus SinP3   

SARS coronavirus SinP4   

SARS coronavirus SinP5   

SARS coronavirus SoD   

SARS coronavirus SZ1   

SARS coronavirus SZ13   

SARS coronavirus di Taiwan   

SARS coronavirus Taiwan JC-2003   

SARS coronavirus Taiwan TC1   

SARS coronavirus Taiwan TC2   

SARS coronavirus Taiwan TC3   

SARS coronavirus TJ01   

SARS coronavirus TJF   

SARS coronavirus Tor2   

 

SARS coronavirus TW   

SARS coronavirus TW-GD1   

SARS coronavirus TW-GD2   

SARS coronavirus TW-GD3   

SARS coronavirus TW-GD4   

SARS coronavirus TW-GD5   

SARS coronavirus TW-HP1   

SARS coronavirus TW-HP2   

SARS coronavirus TW-HP3   

SARS coronavirus TW-HP4   

SARS coronavirus TW-JC2   

SARS coronavirus TW-KC1   

SARS coronavirus TW-KC3   

SARS coronavirus TW-PH1   

SARS coronavirus TW-PH2   

SARS coronavirus TW-YM1   

SARS coronavirus TW-YM2   

SARS coronavirus TW-YM3   

SARS coronavirus TW-YM4   

 

SARS coronavirus TW1   

SARS coronavirus TW10   

SARS coronavirus TW11   

SARS coronavirus TW2   

SARS coronavirus TW3   

SARS coronavirus TW4   

SARS coronavirus TW5   

SARS coronavirus TW6   

SARS coronavirus TW7   

SARS coronavirus TW8   

SARS coronavirus TW9   

SARS coronavirus TWC   

SARS coronavirus TWC2   

SARS coronavirus TWC3   

SARS coronavirus TWH   

SARS coronavirus TWJ   

SARS coronavirus TWK   

SARS coronavirus TWS   

SARS coronavirus TWY   

SARS coronavirus Urbani   

SARS coronavirus Vietnam   

SARS coronavirus WF188   

SARS coronavirus WH20   

SARS coronavirus WHU   

SARS coronavirus xw002   

SARS coronavirus ZJ01   

SARS coronavirus ZJ02   

SARS coronavirus ZJ0301   

SARS coronavirus ZMY 1   

SARS coronavirus ZS-A   

SARS coronavirus ZS-B   

SARS coronavirus ZS-C   

Pipistrello coronavirus RsSHC014 correlato alla SARS   

Betacoronavirus Rp3 / 2004 correlato alla SARS   

Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2   

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